Πώς να προσδιορίσετε ένα βακτήριο

Περιεχόμενο

• στάδια
• Μέθοδος 1 Προσδιορίστε ένα βακτήριο με βαφή Gram
• Μέθοδος 2 Εκτελέστε τη δοκιμή Ziehl-Neelsen Staining Test
• Μέθοδος 3 Μελετήστε τη συμπεριφορά και την εμφάνιση των βακτηριδίων
• Μέθοδος 4 Ερμηνεύστε όλα τα αποτελέσματα

Σε αυτό το άρθρο: Προσδιορίστε ένα βακτήριο με βαφή Gram Εκτελέστε τη δοκιμή χρώσης Ziehl-NeelsenΜελέτη της συμπεριφοράς και της εμφάνισης βακτηριδίωνΠεριγραφή όλων των αποτελεσμάτων43 Αναφορές

Η ταυτοποίηση των βακτηρίων είναι ένα πολύπλοκο έργο. Ένας από τους λόγους είναι ότι, σύμφωνα με εκτιμήσεις, υπάρχουν μεταξύ 10 000 και 1 δισεκατομμύριο βακτηριακά είδη στον κόσμο! Η σωστή αναγνώριση των βακτηρίων είναι πολύ σημαντική, ειδικά στον ιατρικό τομέα, όπου η σωστή θεραπεία μιας νόσου εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τον τύπο του μικροβίου που προκαλεί το πρόβλημα. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η ταυτοποίηση γίνεται με βάση την εξάλειψη. Για να προσδιορίσετε ένα βακτήριο, πρέπει να εκτελέσετε δοκιμές χρώσης, να αναλύσετε την εμφάνισή του και να παρατηρήσετε πώς ανταποκρίνεται καλά σε διαφορετικές συνθήκες. Εάν χρειάζεστε ένα γρήγορο αποτέλεσμα, πάρτε ένα δείγμα DNA για να το στείλετε σε ένα εργαστήριο.

στάδια

Μέθοδος 1 Προσδιορίστε ένα βακτήριο με βαφή Gram

1. Καθορίστε εάν τα βακτήρια είναι θετικά ή αρνητικά κατά Gram. Η χρώση Gram είναι μια μέθοδος διαίρεσης βακτηρίων μεταξύ των δύο πιο συνηθισμένων τύπων: Gram θετικό και Gram αρνητικό. Οι πρώτοι έχουν ένα παχύ κυτταρικό τοίχωμα αποτελούμενο από ένα πολυμερές που ονομάζεται πεπτιδογλυκάνη, το οποίο έχει την καλύτερη χρώση ως τα λεπτά τοιχώματα Gram-αρνητικών βακτηριδίων.
   • Ορισμένοι συνηθισμένοι τύποι θετικών κατά Gram βακτηρίων είναι οι στρεπτόκοκκοι, οι σταφυλόκοκκοι, οι μικροκοκκιοί (ή μικροκοκκίδες) και η λιστερία.
   • Ακολουθούν ορισμένα συνηθισμένα παραδείγματα αρνητικών κατά Gram βακτηρίων: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium και Campylobacter.
2. Λάβετε κατάλληλα προστατευτικά μέτρα. Τα βακτήρια και τα χημικά στοιχεία που θα χρησιμοποιήσετε κατά τη διάρκεια του τεστ θέτουν σε κίνδυνο την υγεία σας. Φορέστε προστατευτικά γυαλιά, γάντια νιτριλίου μίας χρήσης και εργαστηριακή επικάλυψη κατά την εκτέλεση της δοκιμής χρώσης. Μόλις τελειώσετε, βάλτε τα γάντια και όλα τα άλλα μολυσμένα υλικά σε μια ειδική σακούλα. Θυμηθείτε να ακολουθήσετε τις διαδικασίες του εργαστηρίου σας για να απαλλαγείτε από την τσάντα για μολυσμένα προϊόντα.
3. Βάλτε το δείγμα να παρατηρήσει σε μια γυάλινη ολίσθηση. Για να ξεκινήσει η δοκιμή, τοποθετήστε μια σταγόνα ή ένα βακτηριακό δείγμα σε μια αποστειρωμένη διαφάνεια. Στη συνέχεια, σύρετε τη λεπίδα πάνω από έναν καυστήρα Bunsen που ανάβει τρεις φορές για να στερεώσετε το δείγμα και να αποφύγετε να βγει από την πλάκα όταν ξεπλύνετε ή προσθέσετε τα αντιδραστήρια.
4. Προσθέστε 5 σταγόνες μοβ κρύσταλλο στη λεπίδα. Ρίχνουμε στο δείγμα πέντε σταγόνες διαλύματος κρυσταλλικού ιώδους. Περιμένετε ένα λεπτό για να απορροφήσει το δείγμα το κρυσταλλικό ιώδες.
   • Κρατήστε τη λεπίδα στη θέση της με καρφίτσες ρούχων για να μην χρωματίσετε τα χέρια σας.
5. Πλένετε καλά τη λεπίδα για να αφαιρέσετε το λεκέ. Χρησιμοποιήστε μια βρύση ή μια φιάλη συμπίεσης και αφήστε το νερό να τρέξει πολύ αργά για έως και πέντε δευτερόλεπτα για να αφαιρέσετε υπολείμματα μελάνης που δεν έχουν κολλήσει στο δείγμα.
6. Ρίχνουμε πέντε σταγόνες λεπτής λεπτής μεμβράνης Gram στη διαφάνεια. Πρόκειται για μια λύση που αποτελείται από δίοδο, όξινο ανθρακικό νάτριο και διοξείδιο καλίου που προκαλεί την τήξη του ιώδους κρυστάλλου με τα κυτταρικά τοιχώματα των βακτηριδίων. Ρίξτε πέντε σταγόνες του διαλύματος στο δείγμα και αφήστε το για ένα λεπτό.
7. Πλένουμε το δείγμα με αλκοόλη ή γαλακτικό οξύ. Το αλκοόλ και η λακετόνη είναι λευκαντικά και θα εξαλείψουν τη χρώση βακτηριακών κυτταρικών τοιχωμάτων εάν είναι αρνητικά κατά Gram. Ρίξτε μερικές σταγόνες λευκαντικού στο δείγμα και αφήστε το να λειτουργήσει για όχι περισσότερο από τρία δευτερόλεπτα. Στη συνέχεια, δοκιμάστε να ξεπλύνετε απαλά με νερό για πέντε δευτερόλεπτα για να αφαιρέσετε αυτούς τους λευκαντικούς παράγοντες.
   • Εάν αφήσετε το λευκαντικό να λειτουργήσει για μεγάλο χρονικό διάστημα, μπορεί να οδηγήσει στην εξαφάνιση της χρώσης των θετικών κατά Gram βακτηριδίων, με αποτέλεσμα ένα ψευδώς αρνητικό.
8. Εκτελέστε μια δοκιμή αντίθεσης με σαφρανίνη. Η σαφρανίνη είναι μια κόκκινη χρωστική που έρχεται σε αντίθεση με το κρυσταλλικό ιώδες, με αποτέλεσμα να χρωματίζει τα βακτήρια που δεν επηρεάζονται από τη μοβ χρώση. Ρίξτε περίπου πέντε σταγόνες σαφαρανίνης στο δείγμα και αφήστε το για ένα λεπτό. Στη συνέχεια, δοκιμάστε να ξεπλένετε απαλά με νερό για πέντε δευτερόλεπτα.
9. Οπτικοποιήστε το δείγμα σας σε μεγέθυνση 1000X. Τα βακτήρια θα γίνουν μοβ ή μοβ εάν είναι θετικά σε Gram ή ροζ εάν είναι αρνητικά κατά Gram λόγω της σαφαρανίνης.

Μέθοδος 2 Εκτελέστε τη δοκιμή Ziehl-Neelsen Staining Test

1. Χρησιμοποιήστε αυτήν την τεχνική για την ανίχνευση οξέων-γρήγορων βακτηρίων. Αυτά τα είδη περιέχουν μεγαλύτερη ποσότητα λιπιδίων, καθιστώντας τα πιο ανθεκτικά στις βαφές που χρησιμοποιούνται στη χρώση Gram. Τα ανθεκτικά σε οξέα βακτήρια ανήκουν στο γένος Mycobacterium, το οποίο περιλαμβάνει το βακτήριο που ευθύνεται για τη φυματίωση (M. tuberculosis). Για να βάψετε ένα ανθεκτικό στα οξέα βακτήριο, πρέπει να χρησιμοποιήσετε μια κόκκινη βαφή που ονομάζεται καρβολική φούξιν, ανθεκτική στο ξέπλυμα με όξινα ή θειικά οξέα.
2. Λάβετε κατάλληλα προστατευτικά μέτρα. Τα χημικά και βιολογικά υλικά που χρησιμοποιούνται κατά τη χρώση με Ziehl-Neelsen μπορεί να είναι επικίνδυνα. Επιπλέον, θα χρειαστεί να χρησιμοποιήσετε πηγές θερμότητας, όπως ακροφύσιο Bunsen, ηλεκτρική θερμάστρα ή λαμπτήρα αλκοόλης. Ακολουθήστε τις παρακάτω οδηγίες για να εκτελέσετε τη δοκιμή.
   • Βάλτε γυαλιά, γάντια νιτριλίου και εργαστηριακό παλτό.
   • Προσέξτε να μην εισπνεύσετε ατμούς από βαφές και λευκαντικά και μην αφήνετε τα σταγονίδια να εκτοξεύουν τα μάτια ή το δέρμα σας. Κρατήστε τα δοχεία ανοιχτά κάτω από μια κουκούλα.
   • Να είστε πολύ προσεκτικοί όταν θερμαίνετε τη λεπίδα. Οι περισσότερες χημικές ουσίες που χρησιμοποιούνται είναι εύφλεκτες. Μπορεί επίσης να υπάρχουν ίχνη εύφλεκτων ουσιών στις αντικειμενοφόρες πλάκες ή σε άλλο εξοπλισμό.
3. Προετοιμάστε τη λεπίδα. Με κυκλικές κινήσεις, απλώστε ομοιόμορφα μια μικρή ποσότητα του βακτηριακού δείγματος στο κέντρο μιας αποστειρωμένης ολίσθησης. Το δείγμα σας πρέπει να καταλαμβάνει περίπου 10 mm έως 20 mm.
4. Στεγνώστε τη λεπίδα. Τοποθετήστε τη λεπίδα στη δομή στεγνώματος με το δοκίμιο στραμμένο προς τα πάνω. Αφήστε το να στεγνώσει φυσικά για 30 δευτερόλεπτα. Μην προσπαθήσετε να στεγνώσετε τη λεπίδα με ένα πανί.
5. Ασφαλίστε το δείγμα με θερμότητα. Με το δείγμα προς τα πάνω, σύρετε τη λεπίδα δύο ή τρεις φορές πάνω σε έναν αναμμένο καυστήρα Bunsen. Μπορείτε επίσης να τοποθετήσετε τη λεπίδα σε ηλεκτρική θερμάστρα, ρυθμίζοντας τη θερμοκρασία μεταξύ 65 ° C και 75 ° C για τουλάχιστον δύο ώρες. Προσέχετε να μην βράσετε ή να καψετε το δείγμα.
6. Προσθέστε το καρβολικό φούξιν στη λεπίδα. Ρίξτε αρκετές σταγόνες αυτής της λύσης στη διαφάνεια. Χύστε αρκετό για να καλύψετε πλήρως το δείγμα.
7. Ζεσταίνετε τη λεπίδα για να στερεώσετε τη βαφή. Ζεστάνετε προσεκτικά την πλάκα πάνω από έναν καυστήρα Bunsen ή μια λάμπα αλκοόλ, με το δείγμα να κατευθύνεται προς τα πάνω ή να το τοποθετήσετε σε μια ηλεκτρική θερμάστρα. Θερμάνετε τη λεπίδα στους 60 ° C ή μέχρι να αρχίσει να απελευθερώνει ατμό. Αφήστε τη βαφή να δράσει για πέντε λεπτά.
   • Εάν χρησιμοποιείτε ηλεκτρική θερμάστρα, ενεργοποιήστε τη σε 60 ° C. Εάν επιλέξετε τη λαμπτήρα αλκοόλης ή τον καυστήρα Bunsen, θα πρέπει να περιμένετε να δείτε καπνούς.
   • Για να διατηρήσετε τη λεπίδα στην επιθυμητή θερμοκρασία για πέντε λεπτά, θερμάνετε την κατά διαστήματα.
   • Προσέξτε να μην βράσει, καεί ή στεγνώσει το δείγμα.
8. Ξεπλύνετε τη λεπίδα με κρύο νερό. Αφήνετε να κρυώσει για πέντε λεπτά και ξεπλύνετε απαλά για μερικά δευτερόλεπτα με καθαρό νερό. Χρησιμοποιήστε νερό της βρύσης ή φιάλη συμπίεσης για να αφαιρέσετε τους λεκέδες που δεν έχουν κολλήσει στο δείγμα.
9. Ρίξτε στο δείγμα όξινη αλκοόλη ή θειικό οξύ. Χρησιμοποιήστε έναν όγκο αλκοόλης 3% κατ 'όγκο (ο / ο) ή 20% θειικό οξύ για να καλύψετε πλήρως το δείγμα. Αφήστε το οξύ να λειτουργήσει μέχρι το χρώμα να εξασθενίσει και να φτάσει σε μια πολύ έντονη ροζ απόχρωση. Η διαδικασία συνήθως διαρκεί περίπου δέκα λεπτά.
10. Χρησιμοποιήστε καθαρό νερό για να ξεπλύνετε τη λεπίδα. Πλένετε απαλά τη λεπίδα κάτω από μια βρύση ή χρησιμοποιώντας μια φιάλη συμπίεσης. Αφαιρέστε καλά όλα τα υπολείμματα οξέος και βαφής.
11. Προσθέστε τον παράγοντα αντίθεσης. Μόλις ξεπλύνετε την ολίσθηση, ρίξτε τη βαφή πράσινου μαλαχίτη ή μπλε του μεθυλενίου. Αυτές οι δύο λύσεις δημιουργούν ένα γαλαζωπό ή πρασινωπό υπόβαθρο στο οποίο θα προκύψει η κόκκινη χρωστική, καθώς και άλλα βιολογικά υλικά, όπως ανθρώπινα κύτταρα και ανθεκτικά στα οξέα βακτήρια. Αφήστε τις ουσίες να λειτουργούν για ένα έως δύο λεπτά.
12. Ξεπλύνετε και στεγνώστε τη λεπίδα. Ξεπλύνετε καλά με νερό για να απομακρύνετε την περίσσεια αντίθεσης. Μόλις τελειώσετε, στεγνώστε το πίσω μέρος της λεπίδας με ένα στεγνό πανί και αφήστε το να στεγνώσει φυσικά σε μια βάση.
13. Οπτικοποιήστε το δείγμα σας σε μεγέθυνση 1000X. Τα ανθεκτικά στα οξέα βακτήρια θα γίνουν κόκκινα ή σκούρα ροζ. Άλλα βακτήρια, μη βακτηριακά κύτταρα και η βάση της λεπίδας θα γίνουν πράσινα ή μπλε.

Μέθοδος 3 Μελετήστε τη συμπεριφορά και την εμφάνιση των βακτηριδίων

1. Αναλύστε το σχήμα των βακτηρίων. Αφού εκτελέσετε τη δοκιμή χρώσης για να προσδιορίσετε αν τα βακτήρια είναι θετικά κατά Gram, αρνητικά κατά Gram ή ανθεκτικά στα οξέα, είναι καιρός να προσδιορίσετε με μεγαλύτερη ακρίβεια το είδος. Πρώτον, αναλύστε το σχήμα των βακτηρίων στη διαφάνεια. Οι τρεις πιο συνηθισμένες μορφές είναι τα κοκκία (σφαιρικά), οι σπείρες και τα βακίλλια (σχήμα ράβδου).
   • Υπάρχουν διάφορες παραλλαγές αυτών των μορφών. Τα βακτηρίδια στρογγυλού σχήματος (coccus), για παράδειγμα, μπορεί να εμφανίζονται σε ζεύγη (διπλόκοκκοι), σε αλυσίδες, σε σωρούς ή σε ομάδες τεσσάρων (τετράδες).
2. Μάθετε αν τα βακτήρια είναι αερόβια ή αναερόβια. Πάρτε δύο δείγματα βακτηρίων και δημιουργήστε δύο χωριστές κουλτούρες. Το φεγγάρι πρέπει να είναι αναερόβιο (αναπτύσσεται χωρίς οξυγόνο), ενώ το άλλο πρέπει να είναι αερόβιο (που αναπτύσσεται με οξυγόνο). Αποθηκεύστε την αναερόβια καλλιέργεια στους 35 ° C σε χώρο χωρίς οξυγόνο για τουλάχιστον 48 ώρες πριν παρατηρήσετε ανάπτυξη.
   • Εάν τα βακτήρια αναπτύσσονται σε περιβάλλον χωρίς οξυγόνο, αλλά όχι όταν εκτίθενται στο οξυγόνο, αυτό σημαίνει ότι είναι αναερόβια.
   • Αν και αναπτύσσονται σε οξυγονωμένο περιβάλλον, αλλά όχι απουσία οξυγόνου, είναι αερόβια.
   • Όταν αναπτύσσονται και στα δύο περιβάλλοντα, μιλάμε για προαιρετικά αναερόβια βακτηρίδια.
3. Εκτελέστε μια δοκιμασία κινητικότητας. Ένα βακτήριο είναι κινητό εάν μπορεί να κινηθεί μόνο του με ένα ή περισσότερα μαστίγια. Ο βαθμός κινητικότητας είναι πολύ σημαντικός για την αναγνώριση ορισμένων βακτηριακών ειδών. Υπάρχουν διάφοροι τύποι κινητικότητας, αλλά ο ασφαλέστερος και ευανέστερος τρόπος είναι το ημιστερεό μέσο.
4. Δημιουργήστε μια κουλτούρα για τη δοκιμασία κινητικότητας. Προετοιμάστε μια καλλιέργεια βακτηρίων σε ένα ζωμό καλλιέργειας. Ακολουθήστε τις παρακάτω οδηγίες για να προετοιμάσετε το ζωμό της επιλογής σας.
5. Εμβολιάστε την καλλιέργεια σε ημι-στερεό άγαρ για δοκιμές κινητικότητας. Επαλείψτε ένα μέρος της καλλιέργειας του ζωμού με μια αποστειρωμένη βελόνα εμβολιασμού. Τοποθετήστε προσεκτικά τη βελόνα στο ημίσκληρο σωλήνα dagar, όπως το TTC lagar, το οποίο έχετε ετοιμάσει για τη δοκιμή. Η βελόνα πρέπει να διεισδύσει σε 2/3 του άγαρ.
   • Όταν τελειώσετε, αφαιρέστε προσεκτικά τη βελόνα, προσέχοντας να μην υπερβείτε τα όρια της ζώνης εμβολιασμού.
   • Επώαση του σωλήνα στους 30 ° C για 48 ώρες.
6. Διαβάστε το αποτέλεσμα της δοκιμής. Το άγαρ για τη δοκιμασία κινητικότητας θα γίνει κόκκινο σε επαφή με βακτήρια. Εάν είναι κινητά, αυτό το κόκκινο ή ροζ χρώμα θα εξαπλωθεί σε όλη την ουσία. Διαφορετικά, η χρώση θα περιορίζεται στη θέση της ένεσης.

Μέθοδος 4 Ερμηνεύστε όλα τα αποτελέσματα

1. Συγκεντρώστε τα σχόλιά σας. Για να γνωρίζετε το είδος των βακτηρίων, θα πρέπει να συγκεντρώσετε τις πληροφορίες που συλλέγονται από τους πολιτισμούς, τις δοκιμές χρωματισμού και την παρατήρηση των εντύπων. Εάν εξετάζετε τα δείγματα ενός ασθενούς, τα συμπτώματα που παρουσιάζουν μπορεί επίσης να σας βοηθήσουν να προσδιορίσετε το είδος των βακτηρίων που είναι κατάλληλο.
   • Για παράδειγμα, αν οι δοκιμές δείχνουν ότι τα βακτήρια είναι αρνητικά κατά Gram, αναερόβια, μη κινητικά και παρατηρείτε συμπτώματα όπως κοιλιακό άλγος, ναυτία και έμετο στον ασθενή, είναι πιθανό ότι ο ασθενής πάσχει από λοίμωξη Bacteroides. fragilis.
2. Συμβουλευτείτε μια βάση δεδομένων. Υπάρχουν χιλιάδες είδη βακτηρίων στον κόσμο. Είναι αδύνατο να γνωρίζετε τα πάντα από την καρδιά. Θα πρέπει πιθανότατα να συμβουλευτείτε ένα βιβλίο κλινικής μικροβιολογίας ή μια ηλεκτρονική βάση δεδομένων για να συγκρίνετε τα αποτελέσματα των δοκιμών με πληροφορίες σχετικά με τα βακτηριακά είδη.
   • Υπάρχουν εξαιρετικοί πόροι στο διαδίκτυο για την αναγνώριση βακτηρίων, αλλά οι περισσότερες από αυτές τις βάσεις δεδομένων είναι διαθέσιμες στα αγγλικά, συμπεριλαμβανομένων των Patricbrc.org και GlobalRPh. Ωστόσο, εξακολουθείτε να βρίσκετε χρήσιμες πληροφορίες στον ιστότοπο του Διεθνούς Κέντρου Μικροβιακών Πόρων της INRA.
3. Κάνετε ένα γενετικό τεστ για να γνωρίζετε τα ακριβή είδη των βακτηρίων. Σε ορισμένες περιπτώσεις, μπορεί να χρειαστεί να προσδιορίσετε τα είδη βακτηρίων. Η πιο γρήγορη και ευκολότερη μέθοδος είναι να εκτελέσετε μια εξέταση DNA. Οι εξετάσεις DNA είναι επίσης χρήσιμες για την αναγνώριση βακτηρίων ανθεκτικών στις παραδοσιακές μορφές χρώσης και καλλιέργειας. Σήμερα, οι δοκιμές DNA σε μικροοργανισμούς είναι πολύ γρήγορες και μπορούν να είναι έτοιμες σε λιγότερο από δύο ώρες.
   • Αν δεν έχετε πρόσβαση σε ένα εργαστήριο που εκτελεί γενετική αλληλουχία μικροοργανισμών, στείλετε ένα βακτηριακό δείγμα σε μια εξειδικευμένη υπηρεσία.